熒光壽命測量——頻域法和時域法原理簡介

 

熒光壽命測量——頻域法和時域法原理簡介

 

熒光壽命測量原理

熒光壽命是衡量一個熒光基團激發態通過發射光子回到基態的時間。熒光壽命的范圍可以從皮秒到幾百納秒。下面列出一些常見物質的的熒光強度和熒光壽命。

熒光物質

熒光壽命[ns]

最大激發光波長

最大發射光波長

溶劑

ATTO 655

3.6

655

690

吖啶橙(AcridineOrange

2

500

530

PB pH7.8

Alexa Fluor 488

4.1

494

519

PB pH7.4

Alexa Fluor 647

1

651

672

BODIPY FL

5.7

502

510

乙醇

香豆素

2.5

460

505

乙醇

CY3B

2.8

558

572

PBS

CY3

0.3

548

562

PBS

CY5

1

646

664

PBS

熒光素

4

495

517

PB pH7.5

Oregon Green488

4.1

493

520

PB pH9

Ru(bpy)2(dcpby)[PF6]2

375

458

650

嵌二萘

> 100

341

376

吲哚菁綠

0.52

780

820

羅丹明B

1.68

562

583

PB pH7.8

1. 常用的熒光染料和熒光壽命。

 

 

一個處于激發態的物質,當其返回基態,光子數衰減到原來的1/e,或36.8%,所經歷的時間即為熒光壽命:

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939838.png


 

如熒光強度衰減圖(圖1)所示,熒光壽命t是熒光強度衰減到原來1/e的時間。熒光強度與衰減時間的函數:

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939848.png


 

It)是指時間為t時的熒光強度,α是一個標準系數,τ是時間壽命。

了解熒光壽命的基本理論對于理解利用熒光壽命進行定量分析的方法是非常重要的。

目前測定熒光強度的方法主要有時域法頻域法兩種。

時域法

所謂時域法,就是一定發射強度的短脈沖光照射樣品,并記錄時間。短脈沖光以前使用的是閃光燈,分辨率可以達到幾個納秒。現在用的是激光光源,分辨率可以達到皮秒或更短。

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939858.png


 

1。表示的短脈沖光激發下的熒光熒光的衰減圖。

如果用場波長的激發光激發,熒光強度和壽命是一個單指數關系,這時壽命可以也可以用曲線的斜率直接測定。如果壽命時間和激發脈沖光的分辨率比較接近,計算時間壽命必須去除堆積效應。

我們正努力數學的方法研究反堆積對激發脈沖光的影響。可以看到的熒光衰減的曲線形狀(見許多章節[ 2 ])。目前,隨著告訴脈沖激光的出現,這些反堆積過程對于大多數壽命測量已經變得不那么重要了,盡管它們仍然存在。測量時,可以使用與壽命時間相當的光脈沖。

頻域法

頻域法的原理是:

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939868.png


 

E(t)and E0分別是時間在t0的熒光強度,ME是調制系數,http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939878.png
是光束的調制頻率,圖二顯示的是熒光強度和熒光壽命時間的關系。

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939888.png


 

藍色是激發光譜,紅色是熒光光譜,可以顯示它相對于激發光譜的相位偏移

熒光多相位解頻的公式如下:

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939898.png


 

相位移:http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939908.png

這兩種關系都與衰變時間τ有關,用儀器測量解調系數和相位,在不同的調制頻率偏移(通常為15-20),數據對理論模型進行擬合。因此利用相移和相對調制可以確定全程相位τP和全程調制τM.,如果熒光衰減是單指數,然后τPτM將取決于調制頻率。

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939918.png
 

τPτM和的差異主要是頻率形式,即分析方法基礎上的差異,包括壽命和振幅。

必須注意區分總強度f從到α的影響度,即之前說的時間域。這兩個術語之間的關系是由:

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939928.png
 

其中J代表所有成分的總和,α指前因子,τ是這些物質的壽命。

分析

多頻相位和調制數據通常用非線性最小二乘法進行分析,其中實際相位和調制率數據(不是壽命值)適合于單個或多個指數衰減的不同模型。

擬合的質量是通過減少的卡方值判斷

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939938.png


 

除了使用離散指數衰減模型進行衰減分析外,還可以選擇將數據擬合到分布模型。在這種情況下,假定發射態的激發態衰減特性實際上導致了大量壽命分量。下面是一個典型的壽命分布圖。單色氨酸含蛋白-人血清白蛋白。

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939948.png

 

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939958.png


 

圖三所示為頻率響應曲線(相位和調制率VS 調制頻率)。人血清蛋白HAS在激發光源LED300nm,下,使用長通320nm濾片在20℃收集發射信號。使用洛倫茲變換擬合數據(中心點5.4ns,寬度2.9ns,分布98%)和另一個離散擬合數據部分(t=0.51ns,分布0.02%)。這里顯示的分布是Lorentzian,而是取決于系統的衰減動力學,不同類型的分布,如高斯,或不對稱分布(普朗克),可以利用。本文描述了壽命分析的方法。

應用

熒光壽命的測定

熒光壽命是表征熒光物質和熒光性質的重要手段。蛋白質的生物物理研究,例如特定的氨基酸殘基之間的距離由福斯特共振能量轉移(FRET)。此參數主要不受內部過濾效果,靜態淬火和熒光基團的濃度變化的影響。因此有利于臨床和高通量篩選(HTS)應用于鑒別生物樣品高背景熒光的應用。

另外,這個參數在多路復用方面提供了更多的優勢。區分兩個熒光基團的能力,具有相似的光譜但不同的壽命是另一種增加測量參數的方法,例如[ 5 ]。可以利用幾種機制來開發基于壽命的分析方法。有簡單的結合分析,在結合2部分組成(一個被熒光標記)是伴隨著參數的變化。另一種情況是猝滅釋放型分析,淬滅的物質有低但有限的熒光,但最初存在大量過剩。如果熒光化合物被釋放(與互補的DNA鏈結合)(分子信標)或酶促反應)系統的壽命增加。熒光共振能量轉移分析中能量傳遞效率的測量方法,為避免供體和受體之間的光譜重疊問題,可以采用非熒光受體。

熒光壽命的測量

目前使用的大多數熒光傳感器和檢測都是基于強度測量的。雖然這些方法更容易實現,但是需要頻繁校準[ 6 ]。許多基于強度的測量相關的難點,是可以規避使用壽命為基礎的基于壽命的測量,具有與熒光無關的優點。在過去的10年中,許多研究顯示了分析物敏感的熒光壽命的變化。鑒定和特征。其中一些探針列于表2中。關于基于生命周期的詳細討論監測我們參考你在[ 6 ]章節的終身監測章節。

熒光壽命成像

在熒光顯微鏡下測量探針濃度,也為熒光壽命也提供了新的機會。熒光圖像的對比度是建立在每一對探針的熒光壽命的創建圖像點。典型的例子是細胞參數的映射,如pH值、離子濃度或氧。熒光猝滅,熒光共振能量轉移,光子誘導能飽和轉移(寵物)。生命成像技術的生物學應用的例子包括組織表面的掃描,光動力療法,DNA芯片分析,體貌成像和其他(見例[ 7 ])。

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939968.png


 

http://peakscience.cn/upload/images/2017/10/18154939978.png
 

Books and Book Chapters related to Fluorescence Lifetime

1. Lakowicz, J.R. (1999). Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic/Plenum

Publishers, New York.

2. Valeur, B. (2002). Molecular Fluorescence. Wiley-VCH Publishers.

3. Herman B. (1998). Fluorescence Microscopy, 2nd Edition, Springer-Verlag, New York.

4. Baeyens W.R.G., de Keukeleire, D., Korkidis, K. (1991). Luminescence techniques in chemical and biochemical analysis, M. Dekker, New York.

5. Jameson, D. M. and Hazlett, T.L. (1991). Time-Resolved Fluorescence in Biology and Biochemistry, in Biophysical and Biochemical Aspects of Fluorescence Spectroscopy (Dewey, Ed.) Plenum Press, New York.

References

1 Weber, G.; in Hercules, D.M. Fluorescence and Phosphorescence Analysis. Principles and Applications, IntersciencePublishers (J. Wiley & Sons), New York, pp. 217-240 (1966).

2. Cundall, R.B. and Dale, R.E. (Eds.). Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy in Biochemistry and Biology (NatoAdvanced Science Institutes Series. Series a, Life Sciences; Vol. 69, Plenum Pub Corp, New York (1983).

3. Helms, M.K., Petersen, C.E., Bhagavan, N.V., Jameson, D.M.; Time-resolved fluorescence studies on side-directed mutants of human serum albumin. FEBS letters, 408, 67-70 (1997).

4. Alcala, J. R., Gratton E. and Prendergast, F.G.; Fluorescence lifetime distributions in proteins. Biophys. J. 51, 597-604 (1987).

5. Gratton E. and Jameson, D.M.; New approach to phase and modulation resolved spectra. Anal. Chem. 57, 1694-1697 (1985).

6. Szmacinski H. and Lakowicz, J.R.; Topics in Fluorescence Spectroscopy: Vol. 4. Probe Design andChemical SensingLakowicz, J.R. (Ed.), Plenum Press, New York, (1994).

7. Clegg, R. M. Holub, O., and Gohlke, C.; Fluorescence lifetime-resolved imaging: measuring lifetimes in an image. Methods Enzymol. 360, 509-542 (2003).

 

瀏覽量:0

◆  技術文章

球球大作战棒棒糖